硬壳蛤Mercenaria mercenaria于1997年从美国引种至我国，经过20余年的示范推广，已成为我国北至辽宁、南至广西沿海池塘生态混养的重要经济贝类。硬壳蛤具有很强的抗高温和抗低氧能力：成贝耐受温度达35℃；在0.2mg/L极端低氧条件下7天存活率接近100%。自然环境中高温低氧往往不是两个独立的事件，当水温升高时，氧溶解度降低，高温低氧胁迫往往同时发生。硬壳蛤成贝运动能力较弱，只能通过分子调控网络调整其自身生理和生化状态来抵御环境胁迫。因此探究硬壳蛤应对高温低氧胁迫的响应特征，可以为硬壳蛤健康养殖和遗传育种提供数据支撑和理论依据，同时也为双壳贝类生态适应性进化研究提供基础数据。
本研究利用Realtime PCR、比色法、RNA-seq、UPLC-MS/MS以及生物信息学等技术探究了硬壳蛤应对高温低氧胁迫的响应特征。从能量代谢和抗氧化应激方面查明了硬壳蛤应对高温低氧胁迫的生理响应特征。从转录水平、代谢水平和脂质代谢水平揭示了硬壳蛤应对高温低氧胁迫的分子调控机制，筛选出了关键的通路和差异表达基因及代谢物。利用生物信息学技术，在硬壳蛤基因组中鉴定了HSP70和MAPKK基因家族，并进一步查明了其在硬壳蛤应对高温低氧胁迫的表达特征。研究发现，硬壳蛤应对低氧胁迫时，能够调节基因表达和代谢物含量相对稳定，维持机体稳态。硬壳蛤应对协同胁迫的响应特征与单独高温胁迫类似。在高温、低氧和协同胁迫下，硬壳蛤都会通过增强无氧代谢缓解能量供应不足。而在高温和协同胁迫下，硬壳蛤还会增强糖酵解供应能量，积累氨基酸含量增加对胁迫的耐受力，并通过尿素循环缓解氨/氮毒性。在高温、低氧和协同胁迫下，硬壳蛤都会激活抗氧化系统，增加T-AOC能力缓解氧化应激，并维持较为稳定的MDA水平。此外，在高温和协同胁迫下有机渗透剂和维生素等小分子代谢物，戊糖磷酸途径也在缓解氧化应激中发挥着重要作用。抗凋亡可能是硬壳蛤应对短期高温低氧胁迫的核心转录调控机制。在高温和协同胁迫下，硬壳蛤还会上调分子伴侣相关基因、积累热保护剂缓解蛋白质结构损伤，增强内质网蛋白加工和泛素介导蛋白水解维持稳态。可能通过调节甘油磷脂类、甘油脂类和鞘脂类代谢缓解细胞膜损伤。具体研究结果如下：
1、生理响应特征
从亚细胞、分子和生化水平研究了硬壳蛤在高温低氧胁迫下的能量响应特征。在高温、低氧和协同胁迫下，硬壳蛤鳃线粒体受到损伤，出现去极化。在低氧胁迫下，线粒体分裂标记基因fis1和线粒体自噬标记基因pgam5表达量显著增加，而在高温及协同胁迫下，线粒体融合标记基因mfn2和opa1表达量显著降低。硬壳蛤分别通过促进线粒体分裂和自噬，以及抑制线粒体融合，来维持线粒体功能。在高温、低氧及协同胁迫下，乳酸脱氢酶酶活力以及无氧代谢标志物琥珀酸和乳酸含量显著增加，表明硬壳蛤通过增强无氧代谢缓解能量供应不足。除此之外，糖酵解关键限速酶（磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶）酶活力以及糖酵解关键中间代谢物（磷酸二羟丙酮、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸）含量在高温和/或协同胁迫下显著增加，表明硬壳蛤还会通过增强糖酵解供应能量。多种氨基酸以及尿素循环中间代谢物含量在高温及协同胁迫后显著增加，表明氨基酸含量的积累增加了硬壳蛤对高温及协同胁迫的耐受力，并通过尿素循环缓解氨/氮毒性。通过Realtime PCR、LC-MS和比色法测定了抗氧化酶和非酶抗氧化剂变化特征。为了缓解氧化应激，在高温、低氧及协同胁迫下，硬壳蛤激活抗氧化系统，增加T-AOC能力，并维持较为稳定的MDA水平，但采取了不同的抗氧化策略。在低氧胁迫下，GSH起着重要的抗氧化保护作用。在高温胁迫下，SOD酶活力显著升高。在协同胁迫下，硬壳蛤通过增强SOD、CAT和GST酶活力缓解氧化应激。在高温和协同胁迫下，戊糖磷酸途径在缓解氧化应激中也发挥着重要作用。
2、转录调控机制
通过转录组测序，获得了对照组、高温、低氧及协同胁迫下的mRNA表达谱。PCA结果显示，低氧组和对照组表达模式较为接近，而高温组和协同组表达模式较为接近，常温组（对照组和低氧组）与高温组（高温组和协同组）明显分离。凋亡相关通路在低氧胁迫后显著富集，抗凋亡基因（IAP）表达量显著上调，凋亡执行者（Caspase 8和Caspase 3）表达量显著降低，硬壳蛤可能通过抑制细胞凋亡，防止细胞不必要的大量死亡，以应对低氧胁迫。蛋白质折叠是高温胁迫下最显著富集的GO条目，绝大多数分子伴侣基因（如HSP90，HSP60，HSP40，TCP1等）表达量显著上调，硬壳蛤通过上调分子伴侣相关基因缓解蛋白质结构损伤。内质网蛋白加工和泛素介导蛋白水解途径在高温及协同胁迫下显著富集，GSEA结果表明内质网蛋白加工和泛素介导蛋白水解途径在高温及协同胁迫下得到增强，硬壳蛤可能通过增强内质网蛋白加工和泛素介导蛋白水解途径缓解高温及协同胁迫带来的损伤。凋亡是共有差异表达基因显著富集的通路，多条IAP基因在胁迫后表达量上调，抗凋亡可能是硬壳蛤应对短期高温低氧胁迫的核心转录调控机制。
3、代谢调控机制
通过广泛靶向代谢组学方法，在硬壳蛤鳃组织中共鉴定出了810种代谢物，并筛选差异代谢物。在高温、低氧及协同胁迫下，糖酵解和TCA循环等主要供能途径的中间代谢物含量发生显著变化，无氧代谢产物（琥珀酸、延胡索酸、乳酸）和肉碱含量显著积累提示硬壳蛤通过增强无氧代谢和脂肪酸β氧化来供应能量。甘油磷脂类代谢物在高温及协同胁迫后含量显著增加。在高温及协同胁迫下，有机渗透剂和维生素等差异代谢物可能有助于缓解ROS应激。此外，单糖、氧化三甲胺等热保护剂的显著积累有助于维持蛋白质稳态。
4、脂质代谢调控机制
通过广泛靶向脂质组学方法，对高温、低氧、协同胁迫及对照组硬壳蛤鳃组织中的脂质代谢物进行定性定量检测，共鉴定出了913种脂质代谢物。甘油脂类、甘油磷脂类和鞘脂类是最主要的差异脂质代谢物。绝大多数差异脂质代谢物，在胁迫后含量显著积累。硬壳蛤可能通过甘油磷脂代谢、甘油脂类代谢、鞘脂类代谢等通路改变鳃组织的脂质组成。
5、HSP70基因家族鉴定及其在高温低氧胁迫下的表达特征
基于硬壳蛤全基因组序列，使用序列相似性（Blastp）和保守结构域相似性（HMMER）并结合手动矫正方法，在硬壳蛤基因组中鉴定了133条硬壳蛤MmHSP70基因。MmHSP70基因不均等的分布在19条染色体和4条scaffolds上，其中41条MmHSP70基因位于第7号染色体上。系统发育分析显示，MmHSP70蛋白主要分为两大枝，HSP70 12亚家族发生了大规模扩张。共线性分析显示硬壳蛤Mercenaria mercenaria第7号染色体与青蛤Cyclina sinensis第14号染色体存在一个高密度的HSP70共线性区块。获得和丢失分析显示，硬壳蛤获得了62条HSP70基因。串联重复是MmHSP70基因大规模扩张的主要驱动力之一，对串联重复MmHSP70基因对进行选择压力（Ka/Ks）分析，发现其经历了不同程度的纯化选择。而且相同串联重复基因对的MmHSP70具有相似的基因结构和motif。大多数MmHSP70串联重复基因对在常温组（对照组和低氧组）中表达量较高，MmHSP70 B2串联重复基因对在协同胁迫下表达量显著增加。
6、MAPKK基因家族鉴定及其在高温低氧胁迫下的表达特征
基于硬壳蛤全基因组序列，使用Blastp和HMMER相结合的方法，在硬壳蛤基因组中鉴定了5条MmMAPKK基因。MmMAPKK基因分布在三条染色体上。虽然不同双壳贝类的基因组大小差异很大（如硬壳蛤M. mercenaria基因组1.79 Gb，长牡蛎Crassostrea gigas基因组586.8 Mb），但MAPKK基因数量相对稳定。双壳贝类MAPKK蛋白系统发育分析显示，MAPKK分为5个clades，而且相同clade具有相似的motif模式。共线性分析显示硬壳蛤与青蛤有4对MAPKK同源基因对。选择压力分析结果表明硬壳蛤和青蛤MAPKK基因Ka/Ks值均显著小于0.1，表明受到了强烈的纯化选择。在高温胁迫下，MAPKK7、MAPKK4、ERK3和p38表达量显著上调。在协同胁迫下，MAPKK7、MAPKK6、MAPKK4和p38表达量显著上调。结果表明MAPKK4/MAPKK6-p38级联反应可能在硬壳蛤应对高温及协同胁迫中发挥重要作用。

第1章 绪论 1

1.1 前言 1

1.2 双壳贝类应对高温胁迫的响应特征 1

1.2.1 生理响应特征 1

1.2.2 分子调控机制 4

1.3 双壳贝类应对低氧胁迫的响应特征 6

1.3.1 行为适应策略 6

1.3.2 生理响应特征 6

1.3.3 分子调控机制 8

1.4 双壳贝类应对高温低氧协同胁迫的响应特征 10

1.5 本研究的目的、意义与研究思路 11

1.5.1 目的及意义 11

1.5.2 科学问题 11

1.5.3 研究内容及技术路线 11

1.5.4 预期成果 12

第2章 高温低氧胁迫下硬壳蛤生理响应特征 13

2.1 研究背景 13

2.2 材料与方法 13

2.2.1 实验材料和胁迫实验 13

2.2.2 样品收集 14

2.2.3 线粒体膜电位检测 14

2.2.4 RNA提取及荧光定量PCR 14

2.2.5 生化指标检测 15

2.2.6 代谢物含量测定 15

2.2.7 统计分析 15

2.3 实验结果 15

2.3.1 存活率 15

2.3.2 线粒体响应特征 16

2.3.3 能量代谢响应特征 17

2.3.4 抗氧化应激响应特征 20

2.4 讨论 23

2.5 本章小结 26

第3章 高温低氧胁迫下硬壳蛤转录调控机制 27

3.1 研究背景 27

3.2 材料与方法 28

3.2.1 实验材料和样品收集 28

3.2.2 RNA提取 28

3.2.3 文库构建和转录组测序 28

3.2.4 比对到参考基因组和基因表达分析 28

3.2.5 基因差异表达分析 28

3.2.6 GO、KEGG和GSEA富集分析 28

3.3 实验结果 29

3.3.1 转录组测序概况 29

3.3.2 基因表达量 29

3.3.3 差异表达基因分析 30

3.3.4 GO和KEGG功能富集分析 31

3.3.5 基因集富集分析 38

3.4 讨论 40

3.5 本章小结 43

第4章 高温低氧胁迫下硬壳蛤代谢调控机制 45

4.1 研究背景 45

4.2 材料与方法 45

4.2.1 实验材料和样品收集 45

4.2.2 代谢组测序 45

4.2.3 代谢组生物信息学分析 46

4.3 实验结果 46

4.3.1 代谢组表达谱 46

4.3.2 差异代谢物筛选 49

4.3.3 KEGG富集分析 51

4.3.4 高温低氧胁迫下代谢响应的系统分析 52

4.4 讨论 54

4.4.1 糖酵解、无氧代谢和TCA循环 54

4.4.2 脂质代谢 55

4.4.3 有机渗透剂 56

4.4.4 维生素 56

4.4.5 其他代谢反应 57

4.5 本章小结 57

第5章 高温低氧胁迫下硬壳蛤脂质代谢调控机制 59

5.1 研究背景 59

5.2 材料与方法 59

5.2.1 实验材料和样品收集 59

5.2.2 脂质代谢物提取 59

5.2.3 脂质组测序 60

5.2.4 脂质组生物信息学分析 60

5.2.5 转录组数据再挖掘 60

5.3 实验结果 60

5.3.1 脂质组表达谱 60

5.3.2 差异脂质代谢物筛选 63

5.3.3 KEGG富集分析 64

5.3.4 脂质代谢基因分析 66

5.4 讨论 69

5.5 本章小结 72

第6章 HSP70基因家族鉴定及其在高温低氧胁迫下的表达特征 73

6.1 研究背景 73

6.2 材料与方法 73

6.2.1 MmHSP70基因家族鉴定和序列分析 73

6.2.2 基因组定位，基因结构和保守motif特征分析 74

6.2.3 序列比对和系统发育分析 74

6.2.4 共线性分析 74

6.2.5 获得与丢失分析 75

6.2.6 高温低氧胁迫下MmHSP70基因表达模式分析 75

6.3 实验结果 75

6.3.1 HSP70基因家族鉴定及序列分析 75

6.3.2 HSP70基因的染色体分布和重复类型 75

6.3.3 HSP70蛋白系统发育分析 78

6.3.4 硬壳蛤与青蛤HSP70基因共线性分析 79

6.3.5 获得与丢失分析 80

6.3.6 串联重复MmHSP70基因在高温低氧胁迫下的表达模式 81

6.4 讨论 82

6.5 本章小结 84

第7章 MAPKK基因家族鉴定及其在高温低氧胁迫下的表达特征 87

7.1 研究背景 87

7.2 材料与方法 88

7.2.1 MmMAPKK基因家族鉴定和序列分析 88

7.2.2 MmMAPKK基因组定位和基因结构分析 89

7.2.3 序列比对和系统进化分析 89

7.2.4 保守motif分析 89

7.2.5 共线性分析 89

7.2.6 选择压力分析 89

7.2.7 不同组织MmMAPKK基因表达模式分析 89

7.2.8 高温低氧胁迫下MmMAPKK及下游MAPK基因表达模式分析 90

7.3 实验结果 90

7.3.1 MAPKK基因家族鉴定及序列分析 90

7.3.2 MmMAPKK基因的染色体分布和基因结构 91

7.3.3 系统发育和保守motif分析 93

7.3.4 共线性分析 94

7.3.5 选择压力分析 95

7.3.6 MAPKK基因在不同组织的表达模式 96

7.3.7 MAPKK及下游MAPK基因在高温低氧胁迫下的表达模式 96

7.4 讨论 97

7.5 本章小结 99

第8章 研究总结与展望 101

8.1 研究总结 101

8.2 主要创新点 102

8.3 存在问题 102

8.4 研究展望 103

参考文献 105

附录一 荧光定量PCR所用的引物 129

附录二 硬壳蛤HSP70基因在染色体上的分布 131

致  谢 133

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 137