| 题名 | 哈维氏弧菌YeaZ互作蛋白基因克隆表达及其性质研究 |
| 作者 | 芮文鸿 |
| 答辩日期 | 2018 |
| 导师 | 陈吉祥 ; 王永刚 |
| 关键词 | 哈维氏弧菌 YeaZ YjeE YgjD 基因表达 VBNC 酶活性 |
| 学位名称 | 硕士 |
| 英文摘要 | 自然环境微生物资源丰富,但大部分处于不可培养或难培养状态,采用纯培养方法获得的微生物仅占环境中微生物总数的0.01%-10%。许多细菌在不良环境中进入休眠状态,即活的非可培养状态（Viable but nonculturable state,VBNC）,在适宜条件下VBNC状态细菌能复苏为正常的可培养形式。弧菌是自然环境广泛存在的革兰氏阴性菌,其中哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是危害我国水产养殖动物重要病原菌之一,该菌在不良环境下可进入VBNC状态,细胞复苏后仍保持致病性。从VBNC状态恢复为可培养状态的作用机理尚未明确。本论文主要进行了哈维氏弧菌环境适应性相关蛋白YeaZ及主要互作蛋白YjeE、YgjD的研究,进行了yjeE、ygjD基因克隆、结构域特征、基因表达及酶活性分析,并研究了YeaZ活性位点不同突变体的酶活性和生物学作用,以探究哈维氏弧菌环境适应性及存活机制,主要研究内容如下:从哈维氏弧菌SF-1基因组扩增得到yjeE基因,大小为465bp,编码153个氨基酸的蛋白质。序列分析显示,yjeE基因序列与大肠杆菌（Escherichia coli）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻胶弧菌（V.alginolyticus）、拟态弧菌（V.mimicus）等细菌同源基因序列相似性为78%-94%。与大肠杆菌、嗜血流感细菌（Haemophilusinfluenzae）、枯草芽孢杆菌（Bucillus subtilis）同源蛋白的氨基酸序列相似性为55%-68%。将yjeE基因克隆至pCzn1表达载体,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达和Ni离子亲和层析纯化。SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白分子量为18.997 kDa。ATP酶比活力为60.72 U/mg。将纯化的YjeE蛋白直接添加到正常生长的哈维弧菌细胞悬浮液中,发现添加YjeE能促进正常细胞生长。从哈维氏弧菌SF-1基因扩增得到ygjD基因,大小为1020bp,编码340个氨基酸残基的蛋白质,序列分析显示该基因与大肠杆菌、副溶血性弧菌、溶藻胶弧菌、霍乱弧菌（V.cholerae）、坎氏弧菌（V.campbellii）、拟态弧菌、河流弧菌（V.fluvialis）等细菌同源基因序列相似性为77%-94%。将ygjD基因克隆至pET-28a（+）表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,IPTG诱导表达,Ni离子亲和层析分离纯化,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量为39.183kDa。经Western-blotting检测表明该蛋白在胞内表达。进行了哈维氏弧菌SF-1YeaZ蛋白的酶活性位点氨基酸Asp88、Ser185、Trp169、Asp88-Ser185突变体在大肠杆菌BL21表达、纯化和活性分析,以偶氮酪蛋白为底物测定了YeaZ不同突变体的蛋白酶活性变化,发现与野生型相比,突变体的酶活性都有不同程度降低,其中含Asp88-Ser1852个氨基酸突变点的YeaZ突变体蛋白酶活力完全丧失,失去了对VBNC状态哈维氏弧菌细胞的复苏能力。 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 59 |
| URL标识 | 查看原文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/94000]  |
| 专题 | 兰州理工大学 |
| 作者单位 | 兰州理工大学 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 芮文鸿. 哈维氏弧菌YeaZ互作蛋白基因克隆表达及其性质研究[D]. 2018. |
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