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题名嗜盐古菌 Halorubrum kocurii 2020YC7 的嗜盐机制研究
作者丁润庭
答辩日期2022-05
文献子类硕士
授予单位中国科学院大学
授予地点中国科学院海洋研究所
导师刘建国
关键词嗜盐古菌 嗜盐机制 渗透适应 基因组 菌红素
学位名称理学硕士
英文摘要

嗜盐古菌是介于原核生物和真核生物的中间类群,具有独特的嗜盐特性。它们可产生强抗氧化物质菌红素(Bacterioruberin)、细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR)、聚羟基脂肪酸(PHA)以及有渗透保护作用的海藻糖(Trehalose)和甘氨酸甜菜碱(Glycine betaine)等具有开发价值的物质。深入研究嗜盐古菌可拓宽人们对生物系统进化的认知,为发掘生命起源演化的重要证据。通过转基因技术,利用其渗透调节基因,有望为提高作物抗逆能力提供新途径。
本研究以嗜盐古菌Halorubrum kocurii 2020YC7为材料,结合全基因组测序和表达水平分析,通过测定NaCl浓度变化对内源和外源渗透调节物质(钾离子、海藻糖、甘氨酸甜菜碱等)的影响,探讨嗜盐古菌的特殊嗜盐机制,主要结果如下:
1.全基因组测序结果表明:H. kocurii 2020YC7的基因全长为3,727,755 bp,其GC含量较高,占66.24 %,更有利于其在高渗环境中的DNA稳定与生存;H.kocurii 2020YC7的酸性氨基酸比例也很高,占总氨基酸的17.14 %,酸性氨基酸带有更多的负电荷,有利于菌株更好的结合阳离子,进行渗透调节;此外得到蛋白功能注释基因3513个,与渗透调节相关的物质转运有关的拷贝共33个,涉及钾离子、钠离子转运,海藻糖合成,甘氨酸甜菜碱和海藻糖转运,未发现甘氨酸甜菜碱合成相关基因。
2.通过RT-qPCR对渗透调节基因进行了表达分析,发现钾离子摄取基因trkHtrkAkch以及钾离子输出基因kefB表达均与NaCl浓度呈正相关。其中Trk钾离子摄取系统的跨膜蛋白编码基因trkH变化最大,250 g/L组的相对表达量是50 g/L组的近500倍。基因trkAkch以及kefB在250 g/L组的相对表达量分别是50 g/L 组的449 % ± 101 %,339 % ± 22 %,266 % ± 28 %。海藻糖合成基因treS相对表达量与NaCl浓度呈负相关。在没有外源相容性溶质添加时,甘氨酸甜菜碱转运基因bcct和海藻糖转运基因sugA不随NaCl浓度改变而变化。
3.渗透调节物质检测结果显示,菌株细胞内含有大量的钾离子,且钾离子浓度随NaCl浓度增加而上升,最高值出现在200 g/L组中,可达28.67 ± 3.91 μmol/mg protein,约是50 g/L低盐组的7.5倍。菌株细胞内检测到海藻糖,但随NaCl浓度的变化趋势与钾离子相反,NaCl浓度越高,海藻糖浓度越低。未检测到内源甘氨酸甜菜碱的存在,表明该菌株不具备自身从头合成甘氨酸甜菜碱的能力。
外源添加甘氨酸甜菜碱后,H. kocurii 2020YC7细胞内检测到了大量甘氨酸甜菜碱,且浓度与NaCl浓度正相关,在250 g/L NaCl组中其浓度高达15.27 ± 1.20 mg/mg protein。同时,150,200,250 g/L NaCl组的钾离子浓度显著降低(P<0.05)。钾离子浓度由无添加时的23.79 ± 0.29,28.67 ± 3.91,25.70 ± 3.59分别降低到了11.70 ± 0.23,15.36 ± 0.80,14.93 ± 0.77 μmol/mg protein。与此同时,海藻糖浓度只有很少的变化,并且外源添加海藻糖时,高盐度下(150 - 250 g/L)钾离子浓度降低幅度也不明显(P>0.05),表明海藻糖并未参与高盐环境中的渗透平衡。
渗透保护物质甘油对H. kocurii 2020YC7的生长和菌红素积累有明显抑制作用。研究证实上述甘油的抑制作用与其浓度没有直接关系,而与pH显著改变有关。添加甘油后,H. kocurii 2020YC7培养基pH显著降低,呈酸性。通过基因组发掘甘油代谢路径,结合氧电极结果等推测:甘油在细胞内代谢产生了乳酸或者乙酸,使TCA循环底物乙酰辅酶A减少,有氧呼吸速率受抑制,能量生成受阻,进而导致菌株生长与菌红素合成被抑制。
4.此外,研究表明:H. kocurii 2020YC7合成菌红素含量与NaCl浓度有密切关系,盐度150 g/L时,单位菌株菌红素积累量最高(A494/A600可达0.93 ± 0.09),添加草酰乙酸对嗜盐古菌的菌红素积累有显著促进作用(P<0.05)。
综上所述,将H. kocurii 2020YC7的嗜盐机制归纳如下:(1)NaCl浓度为150 - 250 g/L时,钾离子作为主要渗透保护物质发挥渗透调节作用。菌株细胞内占比较高的酸性氨基酸是与这些钾离子结合的基础。钾离子转运通道在NaCl浓度为100 - 150 g/L的区间内被激活。(2)NaCl浓度为200 - 250g/L时,若外界环境中存在甘氨酸甜菜碱时,可通过BCCT家族的转运蛋白进入细胞,协同钾离子进行渗透平衡。(3)NaCl浓度下降到100至50 g/L时,菌株多糖解体进而被淀粉酶/淀粉酶/海藻糖合成酶TreS的催化产生海藻糖,这是其不能在低盐环境中生存的原因之一。海藻糖在高盐环境中(高于100 g/L)不作为H. kocurii 2020YC7的主要渗透保护物质。(4)此外,DNA高GC含量以及菌红素的积累为H. kocurii 2020YC7在高渗环境中的生存提供了保护作用。

语种中文
内容类型学位论文
源URL[http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/178320]  
专题中国科学院海洋研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
丁润庭. 嗜盐古菌 Halorubrum kocurii 2020YC7 的嗜盐机制研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学. 2022.
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