| 题名 | 产丁二酸大肠杆菌的代谢工程与发酵调控 |
| 作者 | 王丹 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2011-05-22 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 邢建民 ; 苏志国 |
| 关键词 | 丁二酸 大肠杆菌 碳酸酐酶 基因共表达 高密度培养 乳糖诱导 生物质水解液发酵 |
| 其他题名 | Metabolic engineering and fermentation regulation of Escherichia coli for succinic acid production |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 丁二酸又称琥珀酸，是一种重要的平台化合物，通常是由石油炼制的方法来生产。由于石油的不可再生性，国内外都在研究如何采用可再生的生物质为原料微生物发酵法生产丁二酸，这是替代传统石油炼制的有效途径。由于天然丁二酸的发酵生产副产物多，丁二酸的产量低、转化率低，严重制约了丁二酸的工业化生产。本论文采用代谢工程的方法成功地构建了转化率高、副产物少的产丁二酸大肠杆菌工程菌株，并通过发酵调控提高了丁二酸的产量和生产率，同时以玉米秸秆水解液为原料进行了丁二酸发酵的研究，为实现丁二酸的生物制造奠定了一定基础。为强化细胞内碳酸氢根离子的供应，提高碳酸酐酶的活性，促进代谢流流向丁二酸积累的方向，提高丁二酸产量，本论文首先实现了蓝藻碳酸酐酶在大肠杆菌中的高效表达，提高了丁二酸的生产能力。工程菌株的丁二酸得率可达到0.39 mol/mol葡萄糖，比野生型大肠杆菌(0.19 mol/mol葡萄糖)得率提高了1.1倍。另外，还成功地构建了大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶的表达载体，研究了上述基因过量表达对大肠杆菌厌氧发酵代谢产物分布的影响。同时也构建了人工操纵子，实现了碳酸酐酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶双基因的共表达，最佳的丁二酸得率为1.47 mol/mol葡萄糖。为了提高丁二酸的发酵产量，研究了发酵调控对工程菌发酵生产丁二酸的影响。以细胞量作为有氧到无氧发酵阶段的转换标志，将高密度发酵策略应用于双阶段的丁二酸发酵。在优化条件下丁二酸的最终产量可达116.2 g/L，生产率为1.55 g/L-h。为了降低生产成本，研究了乳糖在工程菌丁二酸发酵过程中作为诱导剂的可行性。研究表明补加乳糖可促使工程菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活稳定在3.0 U/mg 蛋白，丁二酸产量达到99.7 g/L。厌氧阶段丁二酸的生产率为1.7 g/L-h，得率为1.67 mol/mol葡萄糖。首次进行了野生型和敲除ptsG基因的大肠杆菌利用葡萄糖和木糖混合液发酵丁二酸的比较研究。研究发现，野生型菌株在丁二酸发酵过程中优先利用葡萄糖然后再利用木糖，而敲除ptsG基因的菌株可以同时利用葡萄糖和木糖产生丁二酸。同时进行了工程菌株利用多糖模拟体系和玉米秸秆水解液发酵生产丁二酸的过程研究。在多糖模拟体系总糖浓度为40 g/L的条件下，工程菌SD125的丁二酸产量可达到32.62 g/L，得率为0.77 g/g。在水解液初始糖浓度为44 g/L的条件下，并流加浓缩水解液(200 g/L)维持糖浓度在10 g/L时，丁二酸产量可达到57.81 g/L，得率为0.87 g/g。研究结果表明工程菌株可以高效利用玉米秸秆水解液发酵丁二酸。 |
| 英文摘要 | Butanedioic acid, traditionally named succinic acid, is an important platform chemical and is currently produced through the petroleum-based chemical process. Because of the non-renewable characteristic of the petroleum resource, worldwide concnerns have drawn to the succinic acid synthesis via microbial fermentation. It is considered as an effective method to replace the petrochemical processing. However, natural succinic-acid-producing organisms produce succinic acid with lower titers, lower yields and other byproducts from mixed-acid fermentations. These characteristics add problems to the transformation of this biotechnology into industrial use. In this work, a series engineering strains with higher succinic acid yield were constructed with the strategy of metabolic engineering. The succinic acid titer and productivity were further improved through fermentation regulation. The fermentation with corn stalk hydrolysate was carried out, which laid the basis for the development of a biorefinery economy of succinic acid. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-24 |
| 页码 | 134 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1737]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王丹. 产丁二酸大肠杆菌的代谢工程与发酵调控[D]. 中国科学院研究生院. 2011. |
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