卤代醌是卤代酚及卤代芳香化合物在各种化学和酶促氧化及降解过程中产生的活性中间体或终产物。 1,4 四氯苯醌（ TCBQ ）是五氯酚 PCP ）主要的具有基因毒性和致癌性的醌类代谢物。本课题组之前较为系统地研究了不同氮取代的苯基异羟肟酸类化合物（ Ar(C=O)-N(OH)R）与卤代醌的反应机理。在本文中我们对不同氮取代基的甲基异羟肟酸（ CH 3 (C= N(OH)R ）类化合物与卤代醌的
反应机理进行了系统研究。此外，我们还发现多环芳香基异羟肟酸还可通过光活化机制导致羟基自由基产生及 DNA 损伤。研究内容主要包括以下三个部 分：
      甲基异羟肟酸与氯代醌的反应机制：自由基均裂及Lossen 重排
      我们之前的研究发现苯基异羟肟酸（BHA ）可通过一类新型的两次 Lossen重排反应有效促进 TCBQ 降解，并高效产生二氯二羟基 1,4 苯醌（ DDBQ ）。在本文中，我们探究了甲基异羟肟酸（ AHA ）与卤代醌反应的分子机制。我们发现 AHA/TCBQ 体系中的 DDBQ 的产率（最高 32%32%）显著低于 BHA/TCBQ 体系91%91%）。在对 AHA/TCBQ 反应机制的探索中，通过 5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物（DMPO）为自旋捕获剂的 ESR 自旋捕获实验，我们意外发现， AHA 与 TCBQ反应体系中产生了明显的氮中心自由基信号，结合 ESR 模拟、 15 N 同位素标记及HPLC MS 分析，我们确认氮中心自由基为甲基酰胺自由基（ CH 3 CON(H) H)••）。通过综合应用 HPLC HPLC MS 分析手段并结合盐酸酸化终止反应的方法我们首次分离并鉴定了 AHA/TCBQ 体系中产生的 1:1 加合物，并且进一步发现加合物分解是导致酰胺自由基产生的直接来源。同时，在 AHA/TCBQ 体系中还检测到一种 Lossen 重排主产物（ N 甲基氨基甲酰 氧基 乙酰胺 ）产生。综合上述研究结果，我们提出当异羟肟酸的取代基由苯基（ BHA ）转化为甲基 AHA ）后其与 TCBQ 的反应机制发生了显著变化： BHA/TCBQ 反应体系以 Lossen 重排机制为主，而 AHA/TCBQ 体系以自由基均裂机制为主， Lossen 重排机制为辅。此外，初步结果显示自由基产生体系会进一步降解 DDBQ ，因此，我们推测AHA/TCBQ 体系自由基中间体的产生可能是导致 DDBQ 产率显著低于BHA/TCBQ 体系的主要原因。
      一类新型的可在正常生理条件下由氮中心酰胺自由基介导的氮氧自由基产生新机制
       我们之前的研究发现广泛用于木材保护剂的五氯酚的致癌性代谢产物，四氯氢醌（ TCHQ ）与去铁胺 DFO ）反应产生 DFO 氮氧自由基（ DFO ••）。然而其潜在的分子反应机制尚不清楚。在此研究中，我们选择结构相对简单的 N 甲基 甲基异羟肟酸 N MeAHA ）作为 DFO 的模型化合物，用于进一步的机理研究。与预期结果一样，我们在 N MeAHA /TCHQ 体系中检测到了 N MeAHA 氮氧自由基Ac --(CH 3 )NO 。 有趣并出乎意料的是，当 TCHQ 被 TCBQ TCHQ 的氧化产物）取代时，在 N MeAHA /TCBQ 体系中也检测到了 Ac --(CH 3 )NO 产生， 但并没有检测到四氯半醌自由基 TCSQ 和 TCHQ 。更令人惊讶的是，通过 ESR 自旋捕获研究发现产生了一种新的以氮为中心的酰胺自由基，通过 HPLC MS 进一步鉴定其为 Ac --(CH 3 )N 。 当 N MeAHA 与 其他卤代醌反应时我们观察到相同的Ac --(CH 3 )N 产生 。我们还分离出酰胺自由基的终产物并鉴定为 Ac --(CH 3 )N H 。 综合上述研究结果， 我们提出在 N MeAHA/TCHQ 反应体系中，一种不同寻常的以氮为中心的酰胺基中间体介导的氮氧自由基产生新机制。该自由基均裂机制普遍适用于当其他卤化醌化合物和包括 DFO 在内的 N 烷基异羟肟酸反应体系。这项研究首次报道了一类不同寻常的酰胺基中间体介导的氮氧自由基产生新途径，不仅可以更好地解释之前发现的 DFO 能有效但仅部分保护 TCHQ 诱导的生物损伤，还为由 DFO 和其他 N 烷基异羟肟酸化合物引起的潜在副毒性效应提供了更多的实验证据。
      芳香基异羟肟酸光激活机制：新型的羟基自由基生成及DNA 定点损伤机制研究

      N羟基 2 乙酰基氨基芴（ N OHAAF ）是典型的环境污染物硝基芴 NF ）及多环芳胺的模型化合物 2 乙酰氨基芴（ AAF ）的具有遗传毒性的代谢中间体。N OHAAF 的致癌性先前主要归因于酶代谢激活后亲电性芳香氮正离子的产生，其可与生物大分子如 DNA 形成加合物。我们的研究发现， N OHAAF 暴露于紫外线或阳光照射时也可产生与酶激活相同的 DNA 及蛋白质加合物。更有趣的是，
在光激活 N OHAAF 体系中，除产生 DNA 加合物外，我们还检测到通过包括 DNA链断裂及 8 羟基 2 脱氧鸟苷 8 oxodG ）生成等氧化性 DNA 损伤。典型的羟基自由基OH 清除剂可抑制 DNA 氧化损伤。 ESR 二级自旋捕获和对苯二甲酸TPA 荧光实验明确证实， N OHAAF 的光解可导致高活性的 OH 产生 。化学降解 DNA 测序研究表明， N OHAAF 的光激活会优先导致 DNA 鸟嘌呤位点损伤切割。通过双免疫荧光染色法我们发现成纤维细胞 Balb/c 3T3 细胞共同暴露于N OHAAF/UV 辐射时，可在细胞体系中观察到明显 8 oxodG 和少量 DNA 双链断裂的形成。综上所述，我们提出在紫外光照射激活时， N OHAAF 的 N O 键均裂产生可造成 DNA 氧化和共价损伤的 OH 和酰胺自由基。我们的研究首次报道具有基因毒性的芳香基异羟肟酸中间体可通过光活化路径导致 OH 生成并可能
造成 DNA 特异性碱基损伤。与经典的酶激活产生氮正离子 得到机制相比，本研究提供了一种新的光活化产生自由基机制，这能更好地了解芳香胺致癌尤其是皮肤癌的分子机制。