东海是中国四大海域之一，同时也是有害藻华（Harmful algal blooms，HABs）暴发的重灾区。随着人类活动和全球气候变化的影响增加，中国沿岸海域的藻华物种越来越趋于多样化、小型化和有害化，传统的鉴定方式难以完成东海海域HAB物种的定量分析，也难以处理航次采样中获得的大批量样本和数据。本研究以东海海域为调查目标，利用基于扩增子序列变异子（amplicon sequence variants，ASVs）的宏条形码技术，结合生物信息学分析方法，深度剖析东海海域的HAB物种生物多样性和地理分布规律，验证该海域有害藻华事件频发与HAB物种的高生物多样性相关的科学假设。首次构建了典型HAB物种尖刺伪菱形藻（Pseudo-nitzschia pungens）、尖细伪菱形藻（Pseudo-nitzschia cuspidata）和非HAB物种微孔伪菱形藻（Pseudo-nitzschia micropora）的线粒体基因组。开发出针对尖刺伪菱形藻遗传多样性的高分辨率分子标记，利用比较基因组学的方法，分析伪菱形藻HAB物种与非HAB物种在线粒体基因组上的差异。主要的研究结果有：

1. 东海赤潮站位及邻近海域的有害藻华物种组成

首先扩增水样样本中的18S rDNA V4区序列，经高通量测序后，获得属于浮游植物的3,966条ASVs，分别属于6个门和35个纲，不同的浮游植物类群在该海域具有独特的地理分布模式。根据PR²数据库和Genbank数据库进行物种注释后，监测到237个浮游植物物种，包括58个HAB物种，其中23个HAB物种从未在东海有过报道。在2019年春季东海的赤潮站位S05-1共监测到47个HAB物种，其中东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、灰白下沟藻（Lebouridinium glaucum）和夜光藻（Noctiluca scintillans）的相对丰度较高，说明该站位发生的是一个多原因种的藻华事件。如此高的HAB物种多样性可能是该海域多类型藻华事件频发的一个重要因素。本研究证明了基于ASVs的宏条形码技术的优势，对于细胞形态微小藻类和难以固定物种的鉴定尤为重要。温度和盐度可能是影响该海域浮游植物群落结构和优势HAB物种分布的两个最重要的环境因子，且物种间的相互作用关系也会影响藻华过程。

2. 春季东海海域有害藻华物种的组成和分布特征

针对春季东海海域有害藻华频发的特点，本研究在2019年5月对东海100 m大陆架范围内的广阔海域进行了HAB物种的普查。同样利用基于ASVs的宏条形码技术分析了东海浮游植物群落结构，研究发现甲藻是春季东海海域的第一大优势门类，无论是丰富度还是相对丰度均为最高。本研究监测到249个浮游植物物种，其中178种从未在东海有过相关报道。在71个HAB物种中，有31个未在东海有过报道。10个优势HAB物种中有8个属于甲藻门，只有2个为棕鞭藻门物种。甲藻门的优势HAB物种在各个断面的近岸站位分布较多，棕鞭藻门的优势HAB物种在长江口和杭州湾邻近海域的相对丰度较高。东海的环境因子呈现比较明显的地域差异性，且与浮游植物群落和部分优势HAB物种有显著相关性。通过分析浮游生物各类群之间的相关性，不仅浮游植物与浮游动物之间有显著的相关性，浮游植物之间也存在一定的相关性。东海的水文环境比较复杂，而且高生物多样性的HAB物种在该海域广泛分布，一旦遇到合适的环境条件，这些物种都可能会在东海暴发藻华。这是该海域藻华频发的一个重要原因，也是该海域有害藻华监控和防治工作需要面对的重要挑战。

3. 尖刺伪菱形藻高分辨率分子标记的开发

通过毛细管分离法从东海、渤海和胶州湾海域获得了9株尖刺伪菱形藻单克隆株系。构建了第一个尖刺伪菱形藻线粒体基因组（株系CNS00141）。该环状线粒体基因组长度为40,380 bp，包含35个蛋白编码基因（protein-coding genes, PCGs）、24个转运RNA基因（transfer RNA , tRNA）、2个核糖体 RNA 基因（ribosomal RNA, rRNA）和2个功能未知的开放阅读框（Open reading frames, orfs）。该基因组结构比较独特，除了cox1基因中包含一个II型内含子，还有一段约2 kb的重复区。通过与近缘物种（多列伪菱形藻和克格伦拟脆杆藻）进行比较基因组学分析，发现该基因组的大部分区域比较保守。通过寻找9株藻的线粒体基因组序列单碱基变异位点，开发出了新的分子标记ppmt1，该分子标记比通用分子标记具有更高的分辨率和更高的特异性，在探究尖刺伪菱形藻的地理分布特征和遗传多样性等方面有重要的应用前景。

4. 伪菱形藻属物种比较基因组分析

通过毛细管分离法从东海海域分离到一株尖细伪菱形藻（株系CNS00150），在胶州湾海域分离到一株微孔伪菱形藻（株系CNS00133）。以尖刺伪菱形藻线粒体基因组为参考，首次构建了尖细伪菱形藻和微孔伪菱形藻的线粒体基因组。尖细伪菱形藻的线粒体基因组长度为37,203 bp，微孔伪菱形藻线粒体基因组长度为38,792 bp，两个基因组均包含35个PCGs，24个tRNA，2个rRNA和1个功能未知的orf157。两个藻的线粒体基因组序列长度远远短于尖刺伪菱形藻（40,380 bp）和多列伪菱形藻（46,283 bp）。通过比较基因组学分析，发现新构建的3株藻的大部分序列均很保守，具有很高的共线性关系，其中尖细伪菱形藻和微孔伪菱形藻的基因组结构更为相似。这2个伪菱形藻线粒体基因组均不含有内含子。4个伪菱形藻线粒体基因组均含有一段非基因编码区的重复序列，但重复区序列相差较大。未发现本研究中伪菱形藻属的HAB物种（尖刺伪菱形藻、尖细伪菱形藻和多列伪菱形藻）与非HAB物种（微孔伪菱形藻）在线粒体基因组层面的显著差异。通过系统发育组学分析，尖细伪菱形藻和微孔伪菱形藻的亲缘关系更近，而尖刺伪菱形藻和多列伪菱形藻的亲缘关系更近。

综上所述，本研究的主要创新点在于首次利用基于ASVs的宏条形码技术深入分析了东海海域HAB物种的生物多样性和生物地理分布特征，结合生物信息学方法探讨与浮游植物群落结构和HAB物种分布相关的环境因子和物种间相互作用关系。首次构建了3个伪菱形藻物种的线粒体基因组，开发了一个针对尖刺伪菱形藻的高分辨率分子标记ppmt1。通过比较基因组学分析，剖析伪菱形藻属中HAB物种与非HAB物种在线粒体基因组结构上的异同。利用系统发育组学分析方法，进一步确定了本研究中的4个伪菱形藻属物种的亲缘关系。本论文的研究成果不仅可以为东海海域有害藻华的防控和治理工作提供数据支撑，同时也为HAB物种生物多样性和遗传多样性的研究提供重要参考。