蜈蚣是一种产毒动物，也是一类典型的依靠毒腺和毒液系统进行捕食和防御的节肢动物。蜈蚣毒液成分繁杂，包含多种活性成分，其中各种毒素分子的作用靶点不尽相同，功能各异，因此研究蜈蚣毒素并挖掘其功能，已成为产毒动物研究的一个重要分支。已有研究结果表明，多种蜈蚣毒素的作用靶点为离子通道，且有一定的高效性和专一性。在此基础上，我们拟借助间脚蜈蚣多肽毒素与离子通道之间的相互作用关系，研究毒素与通道的结构功能以及发挥功能的生物学意义。同时，也以离子通道作为工具，研究通道与毒素相互作用的分子机制，了解蜈蚣毒液的成分和功能，为药物筛选和新药的改造研发，提供一种新的工作思路。海南间脚蜈蚣主要分布在中国海南省，目前对其毒液系统的研究成果较少。因此，研究和发掘间脚蜈蚣毒液系统中的活性分子，仍然是蜈蚣毒液研究工作的一个重要方向。本论文以海南间脚蜈蚣毒液系统为研究对象，筛选有生物学活性的毒素分子并对其展开研究。按照“电脉冲刺激采集毒液—葡聚糖凝胶色谱层析分离蜈蚣粗毒—活性初测—HPLC-C18制备柱粗略分离活性成分—活性再测试—HPLC-C18分析柱精细分离活性成分—活性终测—MALDI-TOF质谱鉴定纯度和分子量—Edman降解测其序列”等步骤，从间脚蜈蚣毒液中分离纯化得到一种新型的多肽毒素分子，MALDI-TOF质谱鉴定其荷质比为3698，即其分子量为3698Da，对这一纯品进行Edman降解测序，得其氨基酸序列：AESKGCSAERVKHCLERKCASPCCRHGKCHCGCK。测序结果表明，这一多肽毒素含有34个氨基酸残基，包含八个半胱氨酸，两两配对形成四对二硫键，将其命名为AK34。据其氨基酸序列设计引物构建间脚蜈蚣的cDNA文库，克隆得到能够正确编码AK34的cDNA序列，并成功表达出活性和功能与天然AK34相同的成熟多肽。BLAST比对结果表明，目前尚未出现任何与AK34同源的蛋白，即AK34是一种新型多肽毒素。多肽分子AK34仅含有34个氨基酸残基，却包含8个半胱氨酸，形成四对二硫键。因蛋白分子中每对二硫键的还原动力学不尽相同，借助变性剂盐酸胍和还原剂TCEP，对多肽分子AK34中4对二硫键进行不同程度的还原，通过对还原产物进行烷基化修饰测序和烷基化修饰后酶切二级质谱两种方法，进行AK34的二硫键解析定位。结果表明，AK34分子中的四对二硫键配对方式为：Cys6-Cys14、Cys19-Cys31、Cys23-Cys33、Cys24-Cys29。这种低能耗、高密度的二硫键组织形式，对维系这一多肽的核心结构和生物学功能有着重要的作用，且这一特点在其他已有记录的蛋白中尚未发现。成功解析这一新型多肽毒素的二级结构，对其功能的研究有着重要意义。在成功揭示毒素多肽AK34的一级和二级结构之后，我们通过膜片钳电生理实验研究AK34分子的生物学活性，结果表明500μM的AK34与10μM辣椒素，或3mM2-APB都可完全激活TRPV1通道，说明AK34是一种天然存在的TRPV1离子通道激活剂。且AK34对TRPV1通道的激活具有浓度依赖性，通过Hill函数拟合得到多肽毒素AK34对TRPV1离子通道的半效激活常数为EC50=202.8±49.1μM。了解了多肽毒素AK34的作用靶点及其作用效果之后，我们还展开了间脚蜈蚣毒液酸性微环境对毒素分子功能发挥的意义研究。间脚蜈蚣毒液的pH值为6.2，呈弱酸性，毒液中的各种活性成分均处于酸性微环境中。通过设计不同PH值的实验组，我们发现，pH=6.2时，AK34对TRPV1离子通道的半效激活常数为EC50=50±19μM，较之于中性环境，EC50明显降低，表明酸性环境可以增强AK34与TRPV1离子通道的亲和力，为蜈蚣毒素功能发挥提供有利条件。同时，AK34对TRPV1通道的激活存在着明显的脱敏现象，这一结果表明，AK34对TRPV1通道的激活极有可能采取的是与通道热激活途径相同或者相关的方式，这对我们研究毒素AK34发挥作用的分子机制和解析TRPV1离子通道热激活途径尚未解密的相关影响因素，有着重要的启发作用。本课题研究取得了以下四个方面的进展：1）从间脚蜈蚣毒液中分离得到一种靶向作用于TRPV1离子通道的新型毒素分子AK34，AK34与任何已知蛋白都没有序列同源性；2）多肽毒素AK34是首个被发现的包含四对二硫键的蜈蚣毒素分子，这种高效低耗的二硫键组织形式，对维系这一多肽的核心结构和生物学功能有着重要的意义；3）AK34对TRPV1通道激活同时具有浓度依赖性和PH依赖性，且在低pH条件下能高效激活TRPV1；4）AK34对TRPV1通道的激活存在脱敏现象，表明AK34激活TRPV1通道极有可能是通过通道热激活途径发挥作用。本论文的研究意义包含以下四点：1）通过分离纯化得到一种新型毒素分子AK34，AK34为首个含有四对二硫键的蜈蚣毒素，且与其他已知蛋白都没有序列同源性，丰富了我们对产毒动物毒液系统和毒素分子多态性的认识；2）多肽毒素AK34能在低pH条件下高效激活TRPV1通道，进一步支持酸性环境优化“毒素-受体”结合的理论，说明酸碱微环境等因素的变化可能也是毒液系统进化的一个重要策略；3）TRPV1离子通道是一种重要的疼痛信号感受器，毒素分子AK34能够靶向作用TRPV1通道，这为蜈蚣叮咬引发的疼痛反应机理研究开辟了一条新路径，也为蜈蚣叮咬后止痛药品的研发提供了一种新思路；4）AK34激活TRPV1通道存在脱敏现象，启发我们探究该毒素是否通过通道的热激活途径发挥作用。综上所述，本论文以间脚蜈蚣多肽毒素AK34的结构功能解析为研究重点，揭示了这一多肽毒素复杂的分子结构和生物学功能，也论证了毒液酸性环境可以优化“毒素-受体”结合的理论。激活后脱敏的现象则启发我们进一步深入探究该毒素是否通过通道的热激活途径发挥作用。此外，根据蜈蚣多肽毒素的作用靶点进行止痛药物和治疗药物的研发，或是以毒素分子为探针，靶向作用离子通道来研究通道结构功能，都是新时期研究产毒动物毒液系统的题中之义。