| 题名 | 尿激酶受体(uPAR)及其抗体抑制剂(ATN615)的结构生物学研究 |
| 作者 | 李永东 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2007-06-04 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | 尿激酶受体 尿激酶 抗体 ATN615 Fab X 射线 晶体 |
| 其他题名 | Structural Studies on Urokinase-type Plasminogen Activator Receptor and its Antibody Inhibitor ATN615 Fab Fragment |
| 学位专业 | 物理化学（含：化学物理） |
| 中文摘要 | 尿激酶受体又称CD-87，是一个高度糖基化的单链膜蛋白，它以C端糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜上。研究表明，尿激酶受体由三个富含半胱氨酸的CD59同源结构域（D1，D2，D3）组成， 每个结构域的大小为81－87个氨基酸。尿激酶受体能和包括尿激酶在内的多种配体结合，如玻连蛋白，内吞受体uPARP，G蛋白连接受体和许多种类的整合素。由于这些与细胞表面配体多效性的相互作用，尿激酶受体在多种生理和病理过程中发挥了重要的作用，包括纤维酶原的激活，细胞黏附和迁移，免疫应答，伤口修复，血管再生，炎症反应，特别是癌症侵入和转移。 不含磷脂酰基醇锚链的可溶性尿激酶受体和尿激酶的结合常数等特征均与野生型的全长尿激酶受体接近，是研究尿激酶受体－尿激酶、尿激酶受体－配体相互作用的合适对象。可溶性尿激酶受体在正常的生理条件下可以被检测到，但在恶性肿瘤等病理条件下浓度显著增加。而且可溶性尿激酶受体浓度与肿瘤病人的临床预后成很强的反比关系：尿激酶受体浓度高的病人存活时间短。基于这些以及其它的证据，尿激酶受体－尿激酶系统被认为是抑制癌症转移的重要靶标蛋白质分子。细胞或动物水平的研究发现尿激酶受体的抑制剂在临床上会有抑制肿瘤生长和转移的作用。这些蛋白质－蛋白质相互作用是尿激酶受体-尿激酶系统生物作用的结构基础，同时也可为寻找和设计尿激酶受体抑制剂提供不可或缺的结构信息。 尿激酶受体蛋白容易出现聚集和被蛋白酶降解等现象，且由于糖基化不均一等原因造成蛋白难以结晶。本实验探索用毕氏酵母（Pichia Pastoris）表达系统进行尿激酶受体的表达；同时用S2果蝇表达系统成功表达了糖基化均一的尿激酶受体，并对其纯化方法进行了改进，得到适合进行蛋白质晶体生长的尿激酶受体单体蛋白。同时，我们重点研究了尿激酶受体抗体抑制剂ATN615在分辨率1.77 Å的晶体结构；以及尿激酶受体与其抗体ATN615（在ATF存在下）的复合物在分辨率1.9 Å的晶体结构，在原子水平上确定了该抗体的在尿激酶受体上的抗原结合位点；成功得到尿激酶受体单体的晶体，并进行了结构的初步解析。 1．尿激酶受体在Pichia Pastoris和S2细胞中的表达与纯化 尿激酶受体可溶区域（1－275）克隆至酵母表达载体pPIK9K和pPIKZαA,重组质粒电转化酵母菌X－33，筛选多拷贝表达系suPAR-X33；甲醇诱导表达，上清及细胞破碎液中未检测到suPAR蛋白的表达。更换载体信号肽为尿激酶受体自身信号肽，重新克隆，转化，筛选和诱导表达实验，也未发现suPAR蛋白的表达。 可溶性尿激酶受体在果蝇S2细胞中实现了成功表达。克隆尿激酶受体可溶区域（1－275）至果蝇胚胎细胞表达载体pMT/Bip/v5-his，重组质粒与pCoHygro共转染果蝇S2细胞，筛选多拷贝稳定表达细胞系suPAR S2；suPAR S2表达蛋白经ATF亲和柱、ResourceQ阴离子交换柱或HPLC凝胶过虑几步纯化后，得到高纯度尿激酶受体单体。 2．尿激酶受体抗体抑制剂（ATN615）的晶体结构 抗尿激酶受体单克隆抗体ATN615，采用杂交瘤方法制备，在生理条件下能够与尿激酶受体紧密结合(Kd～1nM)而不与尿激酶竞争。我们已经得到其Fab段晶体并衍射到1.77Å，结构解析R因子23.9%, Rfree 为27.3%。和大多抗体Fab相似，ATN615由一条重链和一条轻链组成；每条链各有两个结构域，即一个可变区和一个恒定区结构域；每个结构域由七到九条β链组成且内有一个二硫键共价连接。抗原结合位点位于可变区顶端，共由六个互补性决定区（CDR）环组成，每条链各有三个，分别命名为L1,L2,L3,H1,H2,以及H3。该抗体互补性决定区环形成一个平坦起伏的平面，具有典型蛋白抗体的特点。 3．抗体抑制剂（ATN615）的抗原结合位点及抗原表位的确立 单克隆抗体可为肿瘤的诊断和治疗提供独特而有效的工具，单克隆抗体相比传统生物药物产品具有难以比拟的技术优势：特异性高、副作用低；可携带各种药物或毒素等到达靶目标，以及诱导针对疾病的免疫力。在结构基础上结合分子生物学、生物信息学等手段进行抗原－抗体相互作用的研究，可以锁定抗原-抗体相互作用的关键位点，并尝试获得更高亲和力的人源化抗体用于肿瘤的诊断和治疗。本实验在ATF（尿激酶负责与受体结合的N末端片段）存在下得到ATN615-suPAR－ATF的三元复合物晶体。ATN615与suPAR的作用位点表明，抗体ATN615主要识别uPAR的第三结构域；它们的识别位点包括11个尿激酶受体残基和来自Fab五个互补性决定区（CDR）环的12个氨基酸残基。其抗原结合区域主要由芳香氨基酸残基组成并形成一个相对平坦起伏的表面。结构表明，尿激酶受体残基Pro188, Asn190, Gly191和Arg192对于抗体的识别起了关键性的作用，同时Pro189及Arg192是人源尿激酶受体的特异性识别残基。该抗体－抗原作用面积很小但是具有很强的结合力，主要为极性相互作用和少量的疏水作用。我们还发现，溶剂分子出现在该抗体－抗原的接触面，这可能是它们之间强相互作用的一个重要原因。抗体分子由于互补性决定区（CDR）环和尿激酶受体的结合导致其在构象上发生了虽小但值得注意的变化。 4．尿激酶受体单体（suPAR）的结构研究 尿激酶受体/尿激酶的多种细胞功能和尿激酶受体能和多种配体在分子水平上相互作用的能力有关。实验表明尿激酶与受体的结合不仅是激活纤维酶原为纤维酶和受体内吞作用的需要，且具有提高uPAR与玻连蛋白的作用能力以及增强受体与整合素的结合力等功效。尿激酶的存在是该受体发挥这些功能所必须的。这就意味着尿激酶受体在没有尿激酶结合即游离状态下具有与结合状态时不同的空间结构，研究游离状态尿激酶受体的结构具有重要的生物学意义。本实验成功地找到了尿激酶受体单体的结晶条件，并收集到分辨率为3Å的衍射数据。初步的结构解析可以预测：该结构与已知的复合物中尿激酶受体的结构有较大的不同。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 87 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7936]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李永东. 尿激酶受体(uPAR)及其抗体抑制剂(ATN615)的结构生物学研究[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2007. |
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