在木质素降解过氧化物酶系中，多功能木质素降解过氧化物酶（VP）正引起人们极大的研究兴趣，主要原因：(i)VP具有不同的活性位点氧化不同的底物（Mn2+、木质素等）；(ii)能直接氧化一些LiP、MnP、CIP等不能直接氧化的化合物。

将密码子优化的杏鲍菇多功能过氧化物酶基因vpl2克隆到载体pET-32a (+)上，并在E. coli BL21 (DE3)中过表达。在IPTG诱导和血红素存在的条件下，带有N-His6-Trx-tag的VP被成功表达。纯化后的融合蛋白能氧化ABTS，Mn2+，VA，RB5等底物，但是酶活受到tag影响。本课题是第一次利用IPTG诱导方法在E. coli表达有活性的多功能木质素降解过氧化物酶。

多功能过氧化物酶属于血红素蛋白，这类蛋白利用H2O2作为电子受体来催化反应。但是底物H2O2极易通过一个自杀失活过程使过氧化物酶失活，因此需要通过蛋白工程的手段来提高酶的H2O2稳定性。

通过序列比对和晶体结构（PDB ID: 2BOQ）分析，鉴别了可能影响VP H2O2稳定性的氨基酸，血红素附近易被氧化的氨基酸：Met152，Met247，Met262，Met265；H2O2结合区附近的氨基酸：Ala77，Ala79，Ile81；血红素结合袋附近的氨基酸：Arg43，Phe46，Pro141，Ser168，Phe186。利用定点突变方法成功构建了17个突变体，包括14个单位点突变体M152F、M247L、M262L、M265L、A77S、A79S、I81L、A77E、P141A、R43L、S168A、F186A、A79L、F46G，1个双位点突变体M247L/M265L，2个三位点突变体A77E/I81L/A79S和A77S/I81L/A79L。

对突变体进行动力学研究。一些突变体的活性大幅降低，如F46G（完全失活），F186A，R43L等，表明这些氨基酸对VP的活性非常重要；一些突变体对动力学参数的影响不大，如M262L，A77S等。有趣的是一些突变体提高了VP的催化效率，如M265L，A77E，I81L，M247L/M265L，A77E/A79S/81L等，特别是S168A，对底物ABTS 催化效率提高了8.6倍。Ser168的羟基和组成远程电子转移途径的Leu165的酰胺氧形成非常强的氢键（2.9 Å）。S168A突变导致和Leu165之间的强氢键作用不再存在，影响了和血红素、Leu165之间的作用，因此影响了远程电子转移，甚至ABTS结合区和Mn2+结合区。

对突变体进行了H2O2稳定性研究。一些突变体对H2O2的稳定性没有太大影响，如A77S，A79L，M152F，M262L等；而一些突变体显著提高了H2O2稳定性，如M247L, M265L, S168A, M247L/M265L，A77E/A79S/I81L等，表明易被氧化的氨基酸，血红素附近的氨基酸，参与远程电子传递过程的氨基酸，H2O2结合袋附近的氨基酸都对VP 的H2O2稳定性有影响。

在17个突变体中，突变体M265L，S168A，以及A77E/A79S/I81L特别有意义，因为它们的催化效率和H2O2都得到提高，尤其S168A。这些结果为进一步提高VP的H2O2稳定性奠定了基础。

Among ligninolytic peroxidases, VP presents especial biotechnological interest due to the following reasons: (i) catalytic versatility by combination of different substrate oxidation sites, and (ii) ability to degrade some compounds of interest that LiP and MnP (as well as CIP) are not able to oxidize directly.

The synthesized vpl2 gene encoding versatile peroxidase from Pleurotus eryngii with codon optimization was cloned into vector pET-32a (+) and overexpressed in E. coli BL21 (DE3). An active peroxidase fused to the thioredoxin–hexahistidine tag was directly obtained by IPTG induction in the presence of hemin. The purified fusion protein was able to oxidize ABTS, VA, Mn2+ and RB5 at moderate rates. The tag has affected enzyme activity. For the first time active versatile peroxidase was directly produced in E. coli under IPTG induction.

Versatile peroxidases are heme-containing enzymes that use H2O2 as the electron acceptor to catalyze many oxidative reactions, however, heme peroxidases are highly prone to inactivation by H2O2 through a mechanism-based suicide inactivation process. Thus, protein engineering has to be carried out for VP in order to improve H2O2 stability.

Based on the protein sequence and crystal structure (PDB ID: 2BOQ) of VP from Pleurotus eryngii, the following amino acids which could affect H2O2 stability of VP were identified, four methionine residues which can be easily oxidized: Met152, Met 247, Met262, and Met165; the residues close to H2O2-binding pocket: Ala77, Ala79, and Ile81; the residues close to the hemin pocket: Arg43, Phe46, Pro141, Ser168, and Phe186. We constructed 17 mutants by site-directed mutagenesis, including 14 single mutants: M152F, M247L, M262L, M265L, A77S, A77E, A79S, A79L, I81L, R43L, F46G, P141A, S168A, F186A, one double mutant M247L/M265L, and two triple mutants A77E/A79S/I81L, A77S/A79L/I81L. 

Their kinetics was investigated. Some mutants showed greatly reduced activity, for example, F46G (completely lost activity), F186A, R43L, demonstrating that these residues are very important to VP activity. Some mutations didn’t affect kinetic parameters too much, such as M262L, A77S. Interestingly some showed increased catalytic efficiencies, for instance, M265L, A77E, I81L, M247L/M265L, A77E/A79S/81L, especially S168A whose catalytic efficiency against ABTS increased 8.6 fold. S168A mutation led to removal of the hydrogen bond between hydroxyl of Ser168 and amide oxygen of Leu165, which had significant effect on long-range electron transfer pathway (composed of Trp164, Leu165, and hemin) and ABTS binding pocket (close to Trp164).

Their H2O2 stability was also studied. Some mutations didn’t improve H2O2 stability, for example, A77S, A79L, M152F, M262L. Whereas some mutants showed significantly increased oxidative stability, such as M247L, M265L, S168A, M247L/M265L A77E/A79S/I81L, demonstrating that oxidizable residues, residues close to hemin, long-range electron transfer pathway, and H2O2-binding pocket had effects on H2O2 stability of VP. 

Among the 17 mutants, M265L, S168A, and A77E/A79S/I81L are of great interest because both their catalytic efficiencies and H2O2 stability were improved, particularly S168A. These results have laid the foundation for further enhancement of H2O2 stability of VP.