| 题名 | 菲律宾蛤仔对典型污染物胁迫响应的分子生物标志物研究 |
| 作者 | 张林宝 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2012-06-03 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 吴惠丰 ; 赵建民 |
| 关键词 | 菲律宾蛤仔 重金属 BaP 抗氧化酶 基因表达 代谢产物 生物标志物 |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 本研究根据目前我国渤海重金属和多环芳烃的污染现状，选择具有环境指示功能的贝类菲律宾蛤仔为研究对象，克隆了多种与I相、II相解毒代谢相关的基因，包括细胞色素P450（CYP450）和7种谷胱甘肽硫转移酶（GST）的同工酶基因。研究了Cd、Cu和BaP作用下菲律宾蛤仔组织内重金属累积规律、抗氧化酶活力变化，解毒代谢酶基因表达调控规律以及代谢产物响应规律，探讨重金属和BaP对菲律宾蛤仔的分子致毒机理，为多指标体系生物标志物环境检测技术的建立提供理论依据。论文获得如下一系列的结果和认识：1. 菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因克隆与表达分析本研究克隆了菲律宾蛤仔多个I相与II相解毒代谢相关基因的全长，包括细胞色素P450（命名为CYP414A1）和GST的7种同工酶基因（分别命名为VpGSTS1、VpGSTS2、VpGSTS3、VpGSTO、VpGSTM、VpGSTR和VpGSTMi）。CYP414A1属于CYP450超家族中一个新的家族，与脊椎动物CYP2家族的同源性最高。7种GST同工酶基因中有三种属于Sigma（VpGSTS1、VpGSTS2和VpGSTS3）家族，其余四种分别属于Omega（VpGSTO）、Mu（VpGSTM）、Rho（VpGSTR）和Microsomal（VpGSTMi）家族。这7种GST同工酶基因分别与软体动物、鱼类和其他无脊椎动物的GST具有较高的序列相似性（38%-63%）。组织表达分析发现，克隆得到的解毒代谢酶基因大部分主要表达于菲律宾蛤仔的肝胰腺组织中，与软体动物肝胰腺是污染物解毒和代谢主要场所的观点相一致。2. 菲律宾蛤仔多指标体系生物标志物对重金属暴露的响应本研究测定了Cd和Cu暴露24、48和96 h后蛤仔肝胰腺和鳃中重金属的积累量。结果发现，蛤仔肝胰腺与鳃组织对重金属Cd和Cu的积累随暴露浓度与暴露时间的增加而增加，具有明显的剂量效应与时间效应。菲律宾蛤仔对Cd的富集速率大于Cu，且肝胰腺中重金属的蓄积量高于鳃。重金属暴露下蛤仔肝胰腺和鳃组织中SOD、GPx与GST活力在大部分情况下均显著升高，但在暴露的某些时段 SOD与GST活力被高浓度Cd与Cu显著抑制。这三种抗氧化酶中SOD对Cd暴露比较敏感，而SOD与GST活力变化对Cu暴露都比较敏感。利用荧光定量 PCR 方法，分析了菲律宾蛤仔CYP414A1与VpGSTs同工酶基因在不同浓度重金属暴露下的时序表达情况。CYP414A1基因mRNA在10与40 μg/L Cd暴露48与96 h后其表达量均显著升高（最高表达量为对照组的2.8倍），但在10与40 μg/L Cu暴露下，其基因表达被显著抑制（最低表达量为对照组的0.4倍）。大部分VpGSTs 同工酶基因mRNA表达量对Cd暴露响应不太明显，其中VpGSTS2基因的转录水平被显著抑制（最低为对照组的0.07倍）。Cu暴露后，VpGSTS2在转录水平的响应最为突出，其mRNA表达量最高达到对照组的11倍。另外VpGSTS1、VpGSTS3与VpGSTM基因的表达量也被显著诱导（为对照组表达水平的2.5-4.8倍）。VpGSTO与VpGSTMi基因表达在Cu暴露下被显著抑制（最低可达对照组的0.07倍）。代谢组学研究表明，重金属暴露引起菲律宾蛤仔鳃组织内代谢图谱发生显著变化，并持续至48或96 h。根据渗透调节物质、柠檬酸循环中间产物以及氨基酸等代谢物含量的上调或下调，推测重金属暴露引起机体能量代谢异常和渗透调节紊乱。其中，镉暴露组中谷氨酸盐含量的显著升高表明Cd具有一定的神经毒性。另外，通过对比发现，代谢产物变化对Cu的响应更加敏感和持久。3. 菲律宾蛤仔多指标体系生物标志物对BaP暴露的响应5与50 μg/L BaP暴露菲律宾蛤仔24、48及96 h后对其组织内抗氧化酶活力产生了一定的影响。蛤仔肝胰腺内抗氧化酶指标变化并不显著，而鳃组织内SOD、GST活力被BaP显著诱导，并表现出一定的时间效应和剂量效应关系。关于解毒代谢酶基因表达调控方面，菲律宾蛤仔在50 μg/L BaP暴露96 h后，CYP414A1基因表达量显著升高，为对照组水平的5.6倍。7种GST同工酶基因中， VpGSTS2和VpGSTR基因表达对BaP暴露最敏感，二者mRNA表达量的最高值均为对照组的6.5倍。同样，VpGSTS3和VpGSTM基因表达量也显著升高，为对照组表达水平的1.7-3.8倍。代谢组学研究表明，50 μg/L BaP暴露24 h能引起蛤仔鳃组织内渗透调节紊乱和厌氧代谢，并在48 h恢复至正常组水平。另外，BaP两个剂量组代谢产物在整个暴露过程中均表现出完全相反的趋势，这可能是由于BaP暴露对菲律宾蛤仔具有一定的毒物兴奋效应。上述结果表明，重金属和BaP在菲律宾蛤仔体内的富集产生了大量的活性氧产物，对机体造成严重的氧化压力，从而刺激SOD和GST迅速合成来清除和转运活性氧产物。重金属和BaP暴露对解毒代谢酶基因表达调控主要表现为两种形式，即表达的诱导和表达的阻遏。本文所研究的I相与II相解毒代谢酶基因在蛤仔应对环境污染物的氧化压力和代谢解毒过程中发挥着巨大的作用，其中CYP414A1、VpGSTS2、VpGSTS3、VpGSTM、VpGSTR基因对Cu或BaP暴露响应最为敏感，具有作为监测海洋环境污染生物标志物的潜能。代谢组学研究表明，重金属和BaP暴露均引起菲律宾蛤仔鳃组织内代谢图谱发生显著变化，主要表现为能量代谢异常和渗透调节紊乱。通过比较三种污染物作用后蛤仔代谢产物的响应情况，发现Cu暴露引起蛤仔鳃组织代谢谱的变化最敏感和持久。 |
| 语种 | 英语 |
| 学科主题 | 环境科学 |
| 公开日期 | 2012-06-25 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.yic.ac.cn/handle/133337/5640]  |
| 专题 | 中科院烟台海岸带研究所知识产出_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张林宝. 菲律宾蛤仔对典型污染物胁迫响应的分子生物标志物研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2012. |
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