| 题名 | I. 转录共激活子PGC-1α与丙型肝炎病毒相互作用研究 II. 丙型肝炎病毒Vero细胞培养系统建立初步研究 |
| 作者 | 蔡华 |
| 答辩日期 | 2014-05-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 彭涛 |
| 关键词 | 转录共激活子 丙型肝炎病毒 细胞凋亡诱导效应因子B 内质网应激 细胞培养系 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 其他题名 | I.The interaction of PGC-1α and HCV II. Preliminary study of HCV Vero cell culture system |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | I．转录共激活子PGC-1α与丙型肝炎病毒相互作用研究 摘 要1 正链RNA病毒与宿主脂代谢密切相关。HCV是正链RNA病毒黄病毒科一个成员，HCV利用宿主脂代谢促进自身感染并造成代谢相关的疾病。HCV利用宿主极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein, VLDL）通路进行自身的包装与释放。转录共激活子PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)是细胞能量代谢的中枢分子，能够与肝细胞核因子HNF4α (hepatocyte nuclear lipoprotein)等结合调控细胞的能量代谢和脂代谢，尤其是VLDL通路。但是PGC-1α与HCV的关系还不清楚。 本论文第一部分对PGC-1α与HCV关系进行系统性的研究。第一章中我们阐明PGC-1α对HCV生命周期的影响及其机制；第二章中我们深入探索HCV调控PGC-1α的机制。在第一章研究中，首先我们发现PGC-1α可以调控HCV病毒的产生。其次，我们发现PGC-1α可以与HNF4α结合，协同调控HCV的生命周期。再次，我们发现PGC-1α和HNF4α共同的下游的细胞凋亡诱导效应因子B（cell death-inducing DFFA-like effector b, CiDeB）参与了HCV生命周期，具体是HCV的复制和包装阶段。更深入的研究发现，CiDeB影响HCV是通过与HCV的NS5A和NS2蛋白相互作用实现的。我们利用酵母双杂交确定CiDeB N端与NS5A DII区域对二者的相互作用是必需的。此外，对其他正链RNA病毒分析发现，CiDeB也能对黄病毒科的另一个成员登革热病毒的生命周期亦有调控作用。 第二章的研究我们发现HCV感染可以上调WT/L PGC-1α的表达，并且是HCV RNA复制依赖的。进一步分析，我们发现启动子上的CREB结合区对PGC-1α 启动子的表达是至关重要的。更深入分析，我们发现HCV感染，特别是HCV RNA复制诱发的内质网应激 （ER stress）介导了CREB的磷酸化，进而上调PGC-1α的表达。此外,HCV复制还能通过ER stress非依赖的去磷酸化FoxO1调控L-PGC-1α的表达。结合第一章的研究结论，揭示HCV通过ER stress诱导了PGC-1α的表达，从而转录调节下游因子CiDeB的表达，从而影响了HCV的生命周期。 本研究，首次系统性的评价PGC-1α与HCV的关系。在PGC-1α的下游发现新的影响HCV生命周期的宿主因子CiDeB及其具体的作用机制。以及发现HCV调节PGC-1α的具体机制。提出一个理论假设：HCV是通过调节PGC-1α这个能量代谢中枢分子，从而调控宿主的脂代谢，从而促进HCV的感染并造成代谢性相关的疾病。为解释正链RNA 病毒中与脂代谢关系最密切的HCV是如何调控脂代谢通路提供一种解释。提出几个CiDeB具体影响HCV生命周期的模型，这些模型的证明将丰富HCV复制和包装的具体机制。同时PGC-1α，HNF4α，CiDeB以及ER Stress等，可作为抗HCV治疗或者治疗HCV相关疾病的药物靶标。通过HCV与脂代谢的研究也为黄病毒科的其他病毒与脂代谢的关系提供线索。 II．丙型肝炎病毒Vero细胞培养系统建立初步研究 摘 要 2 HCV病毒体外细胞培养是HCV整个领域的研究基础也是整个HCV领域的重大难题。HCV体外培养系统难以建立其中一个原因是HCV在体外细胞感染低效。所以，HCV细胞培养系统的建立采用的是渐进式的改造细胞以及/或HCV病毒以获得最终支持HCV入侵，复制，包装和释放整个HCV生命周期的细胞。从2005年第一个HCV Huh7细胞培养系统的建立到目前，HCV细胞培养系统得到一些发展。在一系列人肝细胞和鼠肝细胞建立了HCV培养系统，但是几乎所有的Huh7细胞以外的HCV细胞培养系统，产生的病毒有限，难以用于进一步分析。到目前为止没有一个非人非肝的HCV细胞培养系统。建立一个非人非肝的细胞培养系统对于回答HCV的宿主特异性以及肝细胞嗜性是非常重要的。HCV全病毒疫苗研究也受限于HCV培养系统，到目前为止没有一个在疫苗制备株细胞上建立完整的HCV培养系统。筛选得到动物适应性的HCV病毒是HCV动物模型建立的一个策略。但是现阶段还没有任何一种HCV动物模型的适应性HCV病毒。 本部分的研究选择疫苗制备常用的非洲绿猴肾细胞Vero细胞作为潜在的HCV细胞培养系统。首先我们发现Vero细胞，不能有效的支持HCV的感染和复制。具体表现为入侵效率低下，复制效率不高，难以产生HCV病毒。其次我们通过在Vero细胞过表达人的四种HCV受体CD81，OCLN，CLDN1以及SRBI，发现能够有效的促进HCV感染Vero细胞。表明决定HCV入侵Vero细胞的宿主特异因子主要是四种人的HCV受体。再次，我们发现Vero细胞可以长期低效率支持HCV的复制，表明HCV RNA可以在Vero细胞中复制并产生适应性突变。通过带有neo抗性基因的HCV复制子筛选支持HCV复制的Vero细胞，我们得到了若干个含有HCV复制子（replicon）的Vero细胞。分析复制子上的适应性突变将获得Vero细胞偏好的HCV复制子，从而一定程度解决HCV在Vero细胞中复制效率低的原因。本部分研究初步解决HCV Vero细胞培养系统中关键的HCV入侵和复制生命周期，接下来需要构建稳定表达HCV受体的HCV 复制子干扰素消除（IFN cured）后的Vero细胞以及含有Vero细胞适应性突变的HCV复制子克隆，探索改造的Vero细胞对HCV病毒的包装和释放的支持情况。 本部分研究为建立支持完整HCV生命周期的Vero细胞培养系统的建立奠定基础。HCV Vero细胞培养系统的建立将有助于发现HCV嗜肝性和宿主特异性的原因并为HCV全病毒疫苗的制备提供基础。HCV Vero细胞培养模型的建立，将为筛选猴适应性的HCV病毒提供重要的基础，从而最终为HCV猴动物模型的建立提供基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 179 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1030]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 蔡华. I. 转录共激活子PGC-1α与丙型肝炎病毒相互作用研究 II. 丙型肝炎病毒Vero细胞培养系统建立初步研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2014. |
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