迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性致病菌，可感染多种宿主，尤其是鱼类，长期以来是最为严重的鱼类病原菌之一。研究表明，E. tarda能在宿主吞噬细胞如巨噬细胞中增殖，也能够抵抗宿主血清的免疫杀伤，然而这些现象的内在机制不清楚。本论文的目的是研究E. tarda在巨噬细胞内的侵染途径，探索E. tarda与宿主（半滑舌鳎，Cynoglossus semilaevis）补体调节因子CD59（CsCD59）的相互作用，从而促进我们对E. tarda逃逸宿主细胞免疫杀伤和补体免疫杀伤机制的理解。

    为了研究E. tarda的胞内侵染途径，我们首先验证了本实验室分离的鱼类致病菌E. tarda TX1可侵染小鼠巨噬细胞系RAW264.7并在其中增殖。利用不同内吞途径的抑制剂处理和RNA干扰技术（RNAi），发现抑制网格蛋白（Clathrin）和小窝蛋白（Caveolin）介导的内吞途径能显著地降低E. tarda的入侵，而抑制巨胞饮途径却对E. tarda入侵没有影响；通过免疫荧光实验，发现E. tarda能与Clathrin和Caveolin发生共定位，其比例分别为23.6%和20.4%；抑制Clathrin和Caveolin介导的内吞途径后，RAW264.7对灭活和非灭活E. tarda的相对摄入率都会明显降低，说明这两条内吞途径对E. tarda进入巨噬细胞并非是特异的。内吞体酸化抑制剂处理细胞后，E. tarda的入侵明显降低；免疫荧光显微镜观察发现活E. tarda都可与前期内体（Early endosome）、晚期内体（Late endosome）及内体溶酶体（Endolysosomes）的标志蛋白Rab5、Lamp1和Cathepsin D共定位，其比例分比为29.6%、28.7%和36.7%；Lyso-tracker染色显示E. tarda存在于酸性细胞器中。灭活E. tarda也具有相似的共定位现象。这些结果说明E. tarda进入胞内后会经历前期内体、后期内体及内体溶酶体途径。此外，抑制微丝（Microfilament）和微管（Microtubule）会显著降低E. tarda的入侵，并且E. tarda能够与微丝和微管共定位，说明E. tarda进入巨噬细胞的过程是依赖于细胞骨架的。总而言之，本论文结果首次揭示了E. tarda极有可能是以一种被动和不依赖毒力的方式进入细胞，这种方式依赖于Clathrin-和Caveolin-介导的内吞途径及细胞骨架。

    补体系统是免疫系统中不可缺少的一部分，由多种蛋白组成。其中，CD59是补体系统的一种调节因子，可抑制补体系统膜攻击复合物的形成，保护自身细胞不被补体伤害。为研究E. tarda是否可以利用CD59来逃逸鱼类补体系统杀伤，我们首先对CsCD59进行基因克隆和蛋白表达纯化。序列比对发现CsCD59由107个氨基酸组成，具有保守的CD59结构特征，与已知鱼类CD59氨基酸序列相同度介于33%-46%之间。qRT-PCR检测发现在正常生理条件下，CsCD59在多个组织中表达，在肝脏中表达水平最高，在血中表达量最低；E. tarda等病原菌刺激后，肝脏、脾脏和肾脏中CsCD59的表达水平显著上调。兔血红细胞溶解实验证实重组CsCD59（rCsCD59）能显著地抑制半滑舌鳎补体系统的激活。ELISA和免疫荧光显微镜观察发现rCsCD59能结合E. tarda等革兰氏阴性菌以及Bacillus subtilis等革兰氏阳性菌。这种结合作用对细菌本身存活没有影响，但能显著地提高E. tarda等细菌在半滑舌鳎血清中的存活率。这些结果显示鱼类CD59能促进E. tarda等细菌逃逸补体介导的杀伤作用，E. tarda很可能通过上调CD59的表达并与CD59相互作用而得以在血清中存活。