| 题名 | 海洋来源小单孢菌SCSIO 04089聚酮化合物nenestatin A生物合成中调控与后修饰基因功能研究 |
| 作者 | 蒋晓东 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2017-05-30 |
| 导师 | 张长生,朱义广 |
| 关键词 | 海洋来源放线菌 非典型角环素类化合物 生物合成 调控基因 天然产物 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 中文摘要 | 非典型角环素类化合物通过II型聚酮合酶（PKS）途径合成，是一类结构复杂和活性多样的天然产物。前期研究中，课题组从海洋来源小单孢菌Micromonospora echinospora SCSIO 04089中分离得到非典型角环素类化合物nenestatin A；通过基因组扫描、生物信息学分析鉴定了nenestatin A的生物合成基因簇，并构建了部分基因敲除突变株。 前期研究发现在构建的nenestatin A生物合成基因簇突变株中，绝大多数没有累积代谢中间产物，为详细阐述nenestatin A的生物合成机制带来了困难。本论文在此基础上，以海洋来源小单孢菌M. echinospora SCSIO 04089及其突变株为研究对象，通过优化发酵培养条件，构建同框缺失突变株和超量表达正调控基因等方法，提高突变株合成中间体的的产量；通过体内缺失和体外生化实验，研究后修饰基因的功能，揭示nenestatin A的生物合成机制，取得的结果总结如下： 1.通过对菌株M. echinospora SCSIO 04089进行培养基组分的筛选和盐度优化，确定菌株M. echinospora SCSIO 04089最佳发酵培养基为N4培养基，并且盐度为30‰时次级代谢产物产量最高。 2.采用优化后的培养基对Δnes27、Δnes40和Δnes49进行发酵，HPLC检测发现Δnes40和Δnes27中有明显的次级代谢产物积累，Δnes49的代谢产物变化不显著。对Δnes27进行放大发酵，并从中分离得到了化合物homo-dehydro-rabelomycin E (2)。 3.体外表达蒽酮氧化酶基因nes27，以homo-dehydro-rabelomycin E为底物进行功能验证，发现酶Nes27能够将底物homo-dehydro-rabelomycin E (2)转化生成多个产物。4.构建糖基转移酶基因nes40和nes49同框缺失的突变株；发酵后HPLC检测发现，突变株Δnes49i仍没有明显的代谢产物积累。 5.根据生物信息学分析，在化合物nenestatin A生物合成基因簇中存在3个调控基因。通过体内基因敲除，获得了nes6、nes7和nes58的基因缺失突变株，发酵产物经HPLC分析发现，基因nes6缺失后失去了合成nenestatin A类化合物的能力，基因nes7缺失后，尽管其突变株仍能够合成nenestatin A类化合物，但是产量降低，结果表明基因nes6和nes7均为正调控基因。Δnes58不仅能够合成nenestatin A类化合物，而且化合物的产量得到了提高，表明基因nes58为负调控基因。 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/17404]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（硕士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 蒋晓东. 海洋来源小单孢菌SCSIO 04089聚酮化合物nenestatin A生物合成中调控与后修饰基因功能研究[D]. 2017. |
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