利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质

	利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质
	秦发亮; 刘文文; 李莉; 王锡锋
刊名	中国农业科学
	2014
卷号	47 期号:14 页码:2784-2794
关键词	水稻条纹病毒 SP 酵母双杂交技术灰飞虱 cDNA 文库
ISSN号	0578-1752
其他题名	Screening of Putative Proteins in Vector Laodelphax striatellus Which are Interacted with Disease-Specific Protein of Rice stripe virus by Yeast Two-Hybrid Based on the Split-Ubiquitin
英文摘要	【目的】筛选介体灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)中与水稻条纹病毒(RSV)病害特异蛋白(disease-specific protein,SP)可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV 的分子机制及 SP 在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA 并通过TaKaRa D9086OligtexTM-dT30mRNA Purification Kit 对mRNA 进行纯化。利用SMART 技术合成双链cDNA,利用Axygen 的PCR 纯化回收试剂盒将 ds cDNA 回收纯化,纯化后的ds cDNA 再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR3-N 相连接以构建高质量灰飞虱cDNA 文库,通过电转化的方法对灰飞虱cDNA 文库进行扩增并进行cDNA 文库质量和滴度检测。设计带有SfiⅠ酶切位点的引物以扩增得到目的基因即RSV SP。将带有酶切位点的SP 基因序列连接到载体pDHB1上构成诱饵载体pDHB1-SP。将诱饵载体pDHB1-SP 转化酵母菌NMY51中并提取总蛋白,通过Western Blot 方法检测诱饵载体上的目的基因SP 是否表达,并通过功能验证试验验证诱饵载体是否适合本研究采用的分裂泛素酵母双杂交系统。确定构建的诱饵载体适合本系统后,用诱饵载体与文库质粒pPR3-N 共转化到酵母菌NMY51中以优化cDNA 文库筛选条件并明确3-AT 浓度。对灰飞虱cDNA 文库进行筛选并对筛选结果进行分析,对筛选出来的蛋白进行体内试验以进一步验证是否发生互作。【结果】提取到高质量的灰飞虱总RNA,通过SMART 技术合成的ds cDNA 大小介于0.1—4.5kb。构建的灰飞虱cDNA 文库的库容量超过1.2×10~6cfu,文库滴度为1.12×10~8cfu/mL,扩增文库插入片段平均长度大于1.5kb。载体酶切验证表明诱饵载体pDHB1-SP 成功构建; Western Blot 结果表明诱饵载体pDHB1-SP 能够在NMY51中正常表达;功能验证表明诱饵载体pDHB1-SP 适合该系统。在3-AT 浓度为20mmol·L~(-1)的筛选条件下从构建的高质量的灰飞虱cDNA 文库中筛选得到534个克隆,经测序、Blast 比对最终得到76个可能与RSV 的SP 发生互作的灰飞虱蛋白质。根据SP 在灰飞虱体内的亚细胞定位结果以及通过gene ontology(GO)对蛋白质的功能分析, 挑选出20个蛋白质进行共转和β -galactosidase 检测,结果表明这20个蛋白质均与RSV SP 互作。【结论】通过构建高质量灰飞虱cDNA 文库及酵母双杂交技术,筛选出了与RSV SP 互作的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV 的分子机制,及RSV 的SP在传毒过程中的功能打下了基础。
学科主题	生物化学 ; 植物保护
语种	中文
内容类型	期刊论文
源URL	[http://ir.nais.net.cn/handle/2HMLN22E/136509]
专题	植物保护研究所_植物病害研究室
作者单位	中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京, 100193
推荐引用方式 GB/T 7714	秦发亮,刘文文,李莉,等. 利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质[J]. 中国农业科学,2014,47(14):2784-2794.
APA	秦发亮,刘文文,李莉,&王锡锋.(2014).利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质.中国农业科学,47(14),2784-2794.
MLA	秦发亮,et al."利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质".中国农业科学 47.14(2014):2784-2794.