| 题名 | 茅台酒致香微生物发酵产香的环境影响及在卷烟调香中的应用 |
| 作者 | 李辉 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2014 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 连宾 |
| 关键词 | 环境因素 茅台酒曲黑色部分 微生物多样性 产香细菌 烟叶加香 |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 本文研究了端午时节茅台酒厂微环境的环境因子特征，同时以采自茅台酒厂的成熟酒曲为研究对象，利用构建克隆文库与限制性酶切片段长度多样性分析的非培养方法研究了酒曲黑色部分的细菌多样性，采用产香培养基对其中的产香细菌进行分离筛选，利用响应面方法对其产香条件进行培养优化，同时将茅台酒致香微生物的功能开发与贵州卷烟行业的技术创新相联系，将筛选的茅台酒致香微生物及其代谢产物应用于烟叶发酵及卷烟生产中，用以改善烟叶香味及卷烟的品质。主要研究结果如下： 1、研究了端午时节茅台酒厂微环境中水质和微生物种类因素的特征，分析了特殊时节下环境因素对茅台酒生产独特性的影响。水样分析结果显示，端午时节取得的水样从理化性质、营养元素含量和阴阳离子含量角度分析基本都符合《地表水环境质量标准》（GB 3838-2002）I 类水质要求，此时节水样中常量元素含量变化趋势为：Ca > Mg > Si > Na > K > Al > Fe, 主要阴离子含量变化为：HCO3- > SO42- > NO-3 >Cl-。该结果与茅台酒特征性无机元素含量特殊性基本一致，说明端午时节气候使得赤水河流域石灰岩和白云岩等碳酸盐岩类风化溶解程度加大，元素浸出量增多，此时制曲是茅台酒中无机元素含量比重较其他酒大的原因之一，是茅台酒独特性形成的重要因素之一。空气中的微生物种类分析结果显示，此时节空气中微生物种类主要有：芽孢杆菌属、罗尔斯菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、白地霉、毛霉属、黑曲霉属、青霉属、酿酒酵母和毕赤酵母。这些菌群在大曲发酵过程中大多属于优势功能性菌株，与茅台酒的香味物质成分形成有重要联系，因此端午时节踩曲可以最大限度的富集空气中的有益微生物，也是茅台酒独特性形成的重要因素。 2、建立了茅台大曲黑色部分的细菌16S rDNA 的克隆文库，通过限制性酶切片段长度多样性分析（ARDRA）和16S rDNA 序列分析研究了其细菌群落结构特征及其多样性，同时研究了三株产香细菌的培养和发酵产香特性。结果显示，茅台酒曲黑色部分样品克隆文库中包括14个OTUs。在样品中占优势的菌群集中于放线菌门和厚壁菌门，他们主要分布在放线菌门放线菌纲放线菌目放线菌科放线菌属；放线菌门放线菌纲放线菌目假诺卡氏菌科的Saccharopolyspora sp.；厚壁菌门芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属。筛选出三株产香细菌分别是Bacillus subtilis、B. licheniformis和B. amyloliquefaciens。三株菌株混合发酵后明显增加的产物有丙酸，乙酸甲酯，棕榈酸异丙酯，亚油酸乙酯，2-甲基-2-丁烯，甲酸异丙酯，乙酸甲酯，乙酸，丙酸，2, 3-丁二醇，2-乙基丁酸，1, 3-丁二醇，3-甲基戊酸，2-乙基丁酸，β-苯乙醇，亚油酸乙酯，苯基丙二酸，正十四碳酸，正十五酸，棕榈酸异丙酯，十七烷酸，硬脂酸乙酯，花生酸，它们都是茅台酒的香味物质及其前体物质。 3、自茅台大曲分离到一株嗜热产香芽孢杆菌MT003，研究了温度、接种量、培养时间对其产香的影响，利用响应面分析方法分析了三个因素对茅台酒代表性香味物质（乙酸、2, 3-丁二醇和油酸乙酯）含量变化的影响，利用中心合成设计法，设计了19组实验，最终获得了最优因素组合和经验模型。结果显示，对三种香味物质含量的非线性回归方程模型的模拟度分别为96 %、87.76 %、90.54 %，均较高，说明该响应面分析具有较高的可靠性和参考性。三个影响因素（温度、时间、接种量）中，温度对三种物质含量的影响均最显著，时间次之，接种量影响较小。同时，三种物质含量最优化条件大致遵循相同的规律，即三个影响因素的范围值不是越高或越低越好。综合三种物质含量最优值，三个影响因素的最优化条件分别处于以下范围内：温度（38 ℃-45 ℃）、时间（13-15 d）、接种量（14-17 %）。通过该分析模式的建立可以为深入分析芽孢杆菌在茅台酒生产中的作用提供参考模型，同时为促进芽孢杆菌在改善茅台酒发酵工艺提高茅台酒生产效益中的实际应用提供理论参考和基础数据。 4、将产香菌株及其代谢产物应用于烟叶发酵和卷烟生产，提高卷烟香味和吸味。 将产香菌株的发酵提取液应用于卷烟加香实验的结果显示，12组不同处理的发酵提取液中共检测到169种化合物，初步比较发现其中共有15种茅台酒香味物质成分及其他前体化合物，综合15种化合物含量进行分析比较，结果显示，实验组香味物质成分含量跟空白对照组相比均有明显增加，但酸类、醇类、醛类和酯类物质最大生成量所对应的条件不尽相同，初步确定了不同性质香味物质含量最大值出现的培养条件。此外，处理后烟叶的评吸结果显示，强化菌株在梯度培养12 d后的乙醇提取物喷洒于烟丝后烟丝的吸食丰富感略有提升，舒适感略有提升。综合GC-MS和实际评吸结果分析，实际应用的评吸口感最佳值处于GC-MS结果的最佳值范围内，综合分析上述研究结果可为提高产香菌发酵提取液在烟叶加香中的实际应用效果提供理论依据和技术支撑。 将产香菌株应用于烟叶发酵的结果显示，108箱不同发酵处理的烟叶提取物中共检测到77种化合物，结合茅台酒香味成分及中烟集团提供的烟叶中的香味物质成分的比较，结果显示，发酵后烟叶中共出现了18种茅台酒及卷烟中香味物质成分，根据18种香味物质成分含量变化及评吸结果分析初步确定单菌（枯草芽孢杆菌）40 ℃发酵15 d作为较利于香味物质产生的烟叶发酵工艺。 综上所述，茅台酒厂区域微环境对茅台酒独特性的形成具有重要影响。茅台大曲黑色部分具有一定的细菌多样性，这些微生物通过酶系的生物转化作用对茅台酒发酵过程中独特酒体成分和独特风格的形成有重要影响；三株产香细菌发酵提取物含有茅台酒的主要呈香呈味物质，可应用于卷烟加香环节中；产香细菌在烟叶发酵增香中也能发挥有益作用，应用前景广阔。该研究为进一步认识环境因素和微生物对茅台酒独特品质的贡献，开发利用茅台酒曲这一特殊环境的微生物资源，促进茅台酒曲微生物在其他行业中的应用提供了新的思路，具有重要参考价值。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 环境地球化学 |
| 公开日期 | 2016-12-26 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.gyig.ac.cn:8080/handle/352002/5893]  |
| 专题 | 地球化学研究所_研究生_研究生_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李辉. 茅台酒致香微生物发酵产香的环境影响及在卷烟调香中的应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2014. |
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