| 题名 | 基于与组氨酸结合生成发光基团的环金属铱配合物在细胞成像及生物分析中的应用 |
| 作者 | 王小波 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2011 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 周 明 ; 费 浩 ; 刘云圻 |
| 关键词 | 铱配合物 穿膜肽 多肽标记 活细胞成像 生物分析 |
| 学位专业 | 物理化学 |
| 中文摘要 | 环金属铱配合物具有量子效率高，抗光漂白能力强，激发和发射波长之间的Stokes 位移较大，可通过配体结构的改变而调节从近红到蓝光的发光颜色等优点，在生物成像和生物分析等领域引人关注。金属铱荧光化合物标记具体的生物分子如多肽后用于细胞成像的研究未见报道，基于金属配合物与多肽偶联后用于胞内亚细胞器成像的研究也未见报道。 在已报道的各种铱配合物中，一种与组氨酸结合发射绿色荧光的特殊化合物引起了我们的注意，其最初应用于蛋白染色，但其具体的配位方式尚未阐明，这对开展这类铱配合物新的生物应用具有重要意义。本研究在阐明铱溶剂化合物与组氨酸配位模式的基础上，首次将铱溶剂化合物用于多肽标记，进而开展了铱溶剂化合物标记含有组氨酸的穿膜肽用于细胞成像以及标记抗体用于生物分析的相关研究，主要包括3 个部分： 1. 铱溶剂化合物的选择及其与组氨酸结合时的两种配位模式研究 设计合成了一系列含不同配体结构的铱溶剂化合物，比较它们与组氨酸结合时在PBS(pH=7.4) 缓冲溶液中的溶解度以及荧光发射强度的强弱，从中选择出易溶解于PBS(pH=7.4) 缓冲溶液, 荧光发射强的铱溶剂化合物。 通过组氨酸结构类似物 (组氨酸，组胺，去氨基组氨酸，咪唑) 以及我们设计的含有组氨酸序列的多肽与铱溶剂化合物反应，我们观察到与铱溶剂化合物作用时，含有 -NH2 基团的组氨酸及组胺呈现快速的荧光动力学反应结果，而不含 -NH2 的去氨基组氨酸及咪唑显示出慢速的荧光动力学结果。表明 -NH2 基团以及咪唑基团可以各提供一个N 原子与铱溶剂化合物快速配位。去氨基组氨酸或咪唑与铱溶剂化合物反应时，需要两个咪唑基团各提供一个N 原子与铱溶剂化合物配位，因而反应很慢。两种配位模式的配合物[Ir(ppy)2-histamine]+ 及 [Ir(ppy)2-(imidazole)2]+ 纯化后经1H NMR，质谱表征结果与预期一 致。 铱溶剂化合物与多肽反应时，组氨酸位于N 末端的多肽（HGG）显示快速的荧光动力学结果；表明多肽N 末端组氨酸上的 -NH2 基团以及咪唑基团可以各提供一个N 原子与铱溶剂化合物快速配位。组氨酸位于肽链中间的多肽（Ac-GHG）显示很慢的荧光动力学结果，表明多肽链中肽键上的N 原子不参与快速配位；Ac-KHG 及GHG 的慢速荧光动力学结果表明邻近的赖氨酸侧链的 -NH2 不参与快速配位；Ac-HHG 呈现快速的荧光动力学结果表明两个咪唑基团可以各提供一个N 原子与铱溶剂化合物快速配位。铱溶剂化合物与HGG 及Ac-HHG 反应后产物的质谱表征结果与预期一致。以上结果表明铱溶剂化合物标记多肽时，可在多肽N 末端引入单个组氨酸或在多肽序列中引入两个相邻的组氨酸。 2. 铱溶剂化合物标记多肽用于细胞成像 细胞穿膜肽（cell penetrating peptide, CPP）为一类具有细胞膜穿透能力的短肽，能够有效地将蛋白质、多肽、基因及纳米粒子等转运入细胞内。这些多肽多为富含碱性氨基酸如赖氨酸，精氨酸的序列如Tat，R8 等， 或者具有两亲性质的序列如Pep 等。穿膜肽标记后用于细胞成像的常用荧光标记物多为有机小分子，量子点等。近年来，用过渡态金属配位化合物如钌，铼等标记穿膜肽用于细胞成像已有报道。铱配合物标记穿膜肽在生物成像中的应用未见报道。 两种配位模式的配合物 [Ir(ppy)2-histamine]+ 及 [Ir(ppy)2-(imidazole)2]+ 量子效率高，在PBS (pH=7.4) 缓冲溶液中发光效率较高，能穿过细胞膜进入细胞，并具有特异性染活细胞胞浆的性质。 在阐明铱溶剂化合物与组氨酸结合时两种配位模式的基础上，我们首次将铱溶剂化合物用于多肽标记，建立、发展了一种快速、简便、高效的基于组氨酸与铱溶剂化合物特异性结合的多肽标记方法。我们设计N 端含一个组氨酸的穿膜肽序列，铱溶剂化合物标记后的多肽能进入体外培养的细胞，主要以颗粒状的内吞体的形式分布于胞浆，部分呈现出核定位，与有机染料Rhodamine 标记的穿膜肽具有很好的共定位效果；此外，与有机染料相比，呈现出相对均匀的分布。我们进一步设计多肽序列中含有两个相邻组氨酸的的双功能肽（穿膜线粒体靶向肽），铱溶剂化合物标记后的双功能肽能有效地穿透细胞膜并能靶向到线粒体，显示出与线粒体荧光染料MitoTracker 很好的共定位效应。 3. 铱溶剂化合物标记抗体用于免疫分析 蛋白质和多肽的表面分布着大量较活泼的化学基团，例如α-氨基（-NH2），羧基（-COOH），巯基（-SH），羟基（-OH）等。其中，位于蛋白质N 末端或赖氨酸残基侧链末端的 α-氨基， 以及位于半胱氨酸残基侧链末端的巯基最常被用于同标记化合物或交联剂（crosslinker）交联。目前常用的抗体荧光标记物多为有机荧光分子，荧光标记物上含有能同 α-氨基发生反应的基团如羧基、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸基团；或者能同巯基发生反应的马来酰亚胺基团等。以上这些常用的反应方式中，有些需要在交联基团的活化过程 中添加额外的试剂，这就意味着需要更多的反应步骤和时间来完成标记；有些商业销售的标记化合物则被预先活化以方便用户，但这些化合物受到稳定性和反应条件的限制，不能长期保存。 组氨酸由于其侧链的咪唑基团上的两个N 原子各含有一对孤电子，因而具有较强的与二价金属离子（如Zn++，Ni++，Cu++ 等）的配位能力，本文中采用的基于组氨酸残基特异性的铱溶剂化合物标记抗体的方法具有标记过程简单，快速的特点，标记后的抗体用于荧光免疫分析结果表明：荧光标记的信号可以有效被酶标仪检测设备获取；标记后的抗体可以结合在微孔板表面包被的抗原，其生物活性不受标记化合物交联的影响。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2012-09-10 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://58.210.77.100/handle/332007/685]  |
| 专题 | 苏州纳米技术与纳米仿生研究所_纳米生物医学与安全研究部_离职团队 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王小波. 基于与组氨酸结合生成发光基团的环金属铱配合物在细胞成像及生物分析中的应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2011. |
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